Panen pertama dapat dilakukan setelah tanaman berumur 60-70 hari setelah tanam (HST), tergantung varietas dan kondisi lahan. Pada musim hujan (Oktober-Maret), pertumbuhan pegagan lebih cepat sehingga panen bisa lebih awal sekitar 50-60 HST. Sebaliknya pada musim kemarau (April-September), pertumbuhan melambat dan panen bisa mundur hingga 70-80 HST. Setelah panen pertama, panen selanjutnya dapat dilakukan setiap 15-20 hari sekali. Dalam satu tahun, pegagan dapat dipanen hingga 15-20 kali, tergantung perawatan dan kesuburan tanah.
Cara panen yang benar: gunakan gunting atau pisau tajam yang bersih untuk memotong tangkai daun sekitar 2-3 cm di atas permukaan tanah. Jangan mencabut tanaman karena dapat merusak akar dan menghambat pertumbuhan tunas baru. Pilih daun yang sudah tua (daun ke-3 sampai ke-5 dari pucuk) untuk dipanen, biarkan daun muda (daun ke-1 dan ke-2) tetap tumbuh. Hasil panen per meter persegi bisa mencapai 0,5-1 kg daun segar per panen, tergantung kerapatan tanaman dan kesuburan. Setelah dipanen, daun sebaiknya segera dicuci bersih dan direndam dalam air dingin selama 10 menit untuk menjaga kesegaran, lalu ditiriskan.
Untuk penyimpanan jangka pendek, daun pegagan dapat disimpan dalam wadah tertutup di lemari es (suhu 4-8°C) selama 3-5 hari. Jika ingin menyimpan lebih lama, daun bisa dikeringkan dengan cara diangin-anginkan di tempat teduh selama 2-3 hari hingga benar-benar kering, lalu disimpan dalam toples kedap udara. Hindari menjemur langsung di bawah sinar matahari karena dapat mengurangi kandungan senyawa aktif. Dengan panen yang tepat dan perawatan rutin seperti penyiraman 2 kali sehari (pagi dan sore) serta pemupukan organik setiap 2 minggu, tanaman pegagan dapat terus berproduksi hingga 1-2 tahun.